引文：
[1]John PA,Ioannidis MD,Philip S,et al.Effects of CCR5-Δ32,CCR2-64I,and SDF-13'A Alleles on HIV-1disease progress:aninternational meta-analysis of in-dividual-patient data[J].Ann Intern Med,2001,135(9):782-795.
[2]Sheppard HW,Celum C,Michael NL,et al.HIV-1in-fection in individuals with the CCR5-delta32/delta32genotype:acquisition of syncytium-inducing virus at se-roconversion[J].J Acquir I mmune Defic Syndr,2002,29(3):307-313.
[3]Ioannidis JP,Rosenberg PS,Goedet JJ,et al.Effects of CCR5-delta32,CCR2-64I,and SDF-13'A alleles on HIV-1disease progression:An international meta-a-nalysis of individual-patient data[J].Ann Intern Med,2001,135:782-795.
[4]Gosling J,Monteclaro FS,Atchison RE,et al.Molec-ular uncoupling of C-C chemokine receptor5-induced chemotaxis and signal transduction from HIV-1core-ceptor activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(10):5061-5066.
[5]Stephens JC,Reich DE,Goldstein DB,et al.Dating the origin of the CCR5-D32AIDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes[J].Am J Hum Genet,1998,62(6):1507-1515.
[6]王福生,金磊,刘明旭,等.中国普通人群中HIV-1感染辅助受体和配体基因多态性的分析[J].科学通报,2001,46:569-573.
[7]邓小玲,洪坤学,陈健平,等.四川彝族人群HIV-1辅助受体CCR5△32和CCR2-64I基因多态性分析[J].中华流行病学杂志,2004,25(12):1050-1053.
全文：
HIV-1感染靶细胞,除了需要与靶细胞细胞表面的CD4分子结合外,还需要结合某种辅助受体,如趋化因子受体5(CCR5)、CXCR4、CCR2等。其中CCR5是巨噬细胞嗜性的HIV-1毒株进入细胞的主要协同受体,其编码基因位于3p21。CCR5受体是β趋化因子的受体,由352个氨基酸组成。当CCR5基因的第185号氨基酸密码子以后发生32个碱基的缺失(CCR5△32)时,CCR5翻译后不能发挥受体正常的功能,从而阻止了HIV-1感染靶细胞。我国是一个多民族国家,不同的民族呈现不同的生物个体差异及遗传多态性。有关中国人群中CCR5基因多态性的报道主要集中在汉、藏、维、蒙及哈萨克族等人群中,而未有壮族人群的研究报道。本文通过对广西壮族人群CCR5及其突变体CCR5△32基因型频率进行检测,为研究该地区HIV-1的流行特点、致病机理等提供基础资料。1材料与方法1.1研究人群:在广西土生土长的壮族人群(其自身、父辈和祖辈均是广西壮族人,且与其他民族无血缘关系)中随机选择60例,全部经HIV抗体检测阴性,其中男27人,女33人。年龄3~84岁,平均35岁。1.2方法1.2.1外周血单个核细胞基因组DNA的提取:每份样本取200μL全血,用杭州博日试剂盒(Biospin Whole Blood Ge-nomic DNA Extraction Kit)按说明书提取全血基因组DNA,保存于-20℃。1.2.2引物P1(正向):5′-ACCAGATCTCAAAAAGAAG-GTCT-3′(位于缺失区域上游);Mut1(正向):5′-GCAGCTC-TCATTTTCCATACATTA-3′(3'端3个碱基跨越缺失区域);Mut2(正向):5′-TACAGTCAGTATCAATTCTG-GAA-3′(3'端19个碱基位于缺失区域内);引物P2(反向):5′-CATGATGGTGAAGATAAGCCTCA-3′(位于缺失区域下游)。1.2.3PCR反应体系及条件:反应体积20μL,内含10×buffer(Mg2+)2.0μL,dNTP200μmol/L,各种引物浓度0.2μmol/L,Taq酶1U,模板6μL。循环温度为94℃3min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,72℃延伸10min。1.2.4CCR5△32突变的判断:引物P1/P2扩增片断长度为225bp,Mut1/P2扩增片断长度为190bp,引物Mut2/70扩增片断长度为174bp。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可能产生3种结果:如引物P1/P2扩增(+),Mut1/P2扩增(-),Mut2/P2扩增(+),则CCR5受体为CCR5野生型;如果引物P1/P2扩增(+),Mut1/P2扩增(+),Mut2/P2扩增(-),则为CCR5△32纯合型突变;如果引物P1/P2扩增(+),Mut1/P2扩增(+),Mut2/P2扩增(+),则为CCR5△32杂合型突变。1.2.5目的DNA纯化、测序和分析:随机抽取3份引物P1/P2扩增的PCR扩增产物,用DNA纯化试剂盒(德国Qiagen生产)回收和纯化225bp目的条带,用310型全自动毛细管DNA序列测定仪(美国ABI公司生产)测序,测序引物为P1/P2。用Clustalx1.81软件对所得的3个核酸序列与U95626序列进行比对,分析突变位点。2结果2.1CCR5扩增及电泳:60例个体的血样DNA分别经P1/P2、Mut1/P2及Mut2/P2三对引物扩增,结果均为P1/P2扩增(+),Mut1/P2扩增(—),Mut2/P2扩增(+),即全部研究对象所携带的CCR5基因均为野生型CCR5,未发现CCR5△32突变体,CCR5△32等位基因突变频率为0(图1)。图1CCR5基因片断PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图M:DNA marker;1~3:待测样本1;4~6:待测样本2;7~9:待测样本33个样本分别用引物P1/P2、Mut1/P2及Mut2/P2扩增。由于3个样本均为P1/P2扩增(+),Mut1/P2扩增(—),Mut2/P2扩增(+),其CCR5基因均确定为CCR5野生型。2.2Clustalx比对结果:3个序列经与U95626序列比较,发现3个样本DNA的该段序列全部保持完整,无△32缺失现象。序列分析的结果与PCR扩增的结果一致。结合PCR扩增和序列分析结果,全部60个研究对象所携带的CCR5基因应为野生型。3讨论HIV-1病毒株根据其利用的辅助受体的不同分为R5嗜性、X4及R5/X4嗜性毒株。R5嗜性毒株利用CCR5;X4嗜性毒株利用CXCR4,R5/X4嗜性毒株既能利用CCR5,也能利用CXCR4。HIV-1感染早期通常为单核-巨噬细胞嗜性(R5)毒株感染,该病毒感染细胞主要经过以下过程:首先是病毒gp120与细胞CD4分子结合,病毒吸附到宿主细胞上,gp120亚蛋白结构发生改变,使V3区暴露;共受体CCR5分子N端有二硫键的酪氨酸和酸性的氨基酸粘附到V3区,gp120构象发生变化并与gp41分离;随之gp41产生一系列构象变化,自身形成螺旋六聚体结构,gp41蛋白亚分子的N端疏水区朝细胞膜方向移动并与细胞膜的融合,病毒核酸进入细胞。CCR5基因在其编码区及启动子区域可发生多种变异,其中CCR5△32突变由于对HIV感染可产生抗性而受到了广泛的关注。CCR5△32突变包括纯合性和杂合性突变。CCR5△32纯合型可使感染HIV的机会显著下降,并可使HIV感染者从病毒携带状态转变为艾滋病的时间延长,CCR5△32杂合型虽然不能降低感染HIV的机会,但对HIV感染者病情的发展也有减缓的作用[1]。CCR5△32纯合型能抵抗HIV-1病毒的感染,可能是由于突变基因翻译为截短的、无功能的CCR5穿膜蛋白质,使HIV-1gpl20不能与CCR5△32有效结合,从而阻止了HIV-1病毒进入宿主细胞[2,3]。由于生存环境的选择作用,不同民族CCR5△32的携带率明显不同。欧洲大陆、中东和印度次大陆人群携带率为2%~5%[4],欧洲高加索人可能是由于经历了中世纪腺鼠疫、天花等疾病流行的选择压力,造成CCR5△32等位基因突变率高至5%~14%,普通欧美白人也达到了8%,而非洲、美洲土著人和东亚人缺乏该基因型[5]。在中国,汉族人群CCR5△32突变率为0.12%,蒙古族为1.10%,新疆维吾尔族为3.48%,藏族、傣族、景颇族为0[6],四川彝族人群0.84%[7]。在本研究中,研究对象在壮族人群中具有一定的代表性,其自身、父辈和祖辈均是广西壮族人,且与其他民族无血缘关系。本次研究发现该人群CCR5△32等位基因突变率为0,低于欧美、中东和西亚国家,而与国内的汉族、藏族、傣族、景颇族等多个民族相近。据此,我们推测广西壮族人群对HIV感染可能具有较高的遗传易感性。本研究在广西首次对土生土长的壮族人群CCR5和CCR5Δ32等位基因突变频率进行了研究,对评估广西壮族人群对HIV-1感染的遗传易感性,对了解广西HIV的流行特征、制定AIDS防治政策具有一定的参考价值。广西壮族人群CCR5等位基因多态性的研究@麦志丹$广西壮族自治区职业病防治研究所
@臧宁$广西医科大学!南宁530021
@苏齐鉴$广西医科大学!南宁530021
@吴书志$广西医科大学!南宁530021
@苏洁寒$广西医科大学!南宁530021
@沈菁$广西医科大学!南宁530021
@肖信$广西医科大学!南宁530021
@闭志友$广西医科大学!南宁530021
@梁浩$广西医科大学公共卫生学院&艾滋病研究中心目的:了解广西壮族人群中HIV-1辅助受体趋化因子受体5(CCR5)及其突变体CCR5△32等位基因的频率。方法:以60名土生土长的广西壮族人群为研究对象,根据CCR5△32碱基缺失位置采用3对特异性引物,用PCR扩增全血DNA样本,根据扩增结果判断CCR5野生型和CCR5△32突变体。从中随机抽取3份PCR扩增产物进行测序,通过测序结果与野生型的U95626序列比较来验证PCR扩增结果。结果:60份样本均为CCR5野生型,未发现CCR5△32突变体。结论:广西壮族人群对HIV-1病毒感染可能具有较高的遗传易感性。壮族;;人类免疫缺陷病毒;;CCR5;;CCR5△32[1]John PA,Ioannidis MD,Philip S,et al.Effects of CCR5-Δ32,CCR2-64I,and SDF-13'A Alleles on HIV-1disease progress:aninternational meta-analysis of in-dividual-patient data[J].Ann Intern Med,2001,135(9):782-795.
[2]Sheppard HW,Celum C,Michael NL,et al.HIV-1in-fection in individuals with the CCR5-delta32/delta32genotype:acquisition of syncytium-inducing virus at se-roconversion[J].J Acquir I mmune Defic Syndr,2002,29(3):307-313.
[3]Ioannidis JP,Rosenberg PS,Goedet JJ,et al.Effects of CCR5-delta32,CCR2-64I,and SDF-13'A alleles on HIV-1disease progression:An international meta-a-nalysis of individual-patient data[J].Ann Intern Med,2001,135:782-795.
[4]Gosling J,Monteclaro FS,Atchison RE,et al.Molec-ular uncoupling of C-C chemokine receptor5-induced chemotaxis and signal transduction from HIV-1core-ceptor activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(10):5061-5066.
[5]Stephens JC,Reich DE,Goldstein DB,et al.Dating the origin of the CCR5-D32AIDS-resistance allele by the coalescence of haplotypes[J].Am J Hum Genet,1998,62(6):1507-1515.
[6]王福生,金磊,刘明旭,等.中国普通人群中HIV-1感染辅助受体和配体基因多态性的分析[J].科学通报,2001,46:569-573.
[7]邓小玲,洪坤学,陈健平,等.四川彝族人群HIV-1辅助受体CCR5△32和CCR2-64I基因多态性分析[J].中华流行病学杂志,2004,25(12):1050-1053.
